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食品安全國家標準-食品微生物學檢驗

码报四不像:食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗(GB 4789—2012)

錄入時間:2012-7-9 9:02:54 來源:國家衛生部

2019码报资料046期 www.bjbve.icu 前言
本標準代替 GB/T 4789.13—2003《食品衛生微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗》。
本標準與 GB/T 4789.13—2003 相比,主要變化如下:
——修改了標準的中文名稱;
——修改了樣品制備過程;
——修改了培養基與試劑;
——修改了操作步驟;
——修改了菌數計算部分;
——增加了附錄 A。



食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗
1 范圍
本標準規定了食品中產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的檢驗方法。
本標準適用于食品中產氣莢膜梭菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
a)恒溫培養箱:36 ℃±1 ℃;
b)冰箱:2 ℃~5℃;
c)恒溫水浴箱:50℃±1 ℃,46℃±0.5℃;
d)天平:感量 0.1 g;
e)均質器;
f)顯微鏡:10×~100×;
g)無菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭;
h)無菌試管:18mm×180mm;
i)無菌培養皿:直徑 90 mm;
j)pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙;
k)厭氧培養裝置。
3?培養基和試劑
3.1胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸(TSC)瓊脂:見附錄 A 中 A.1。
3.2液體硫乙醇酸鹽培養基(FTG):見附錄 A 中 A.2。
3.3緩沖動力-硝酸鹽培養基:見附錄 A 中 A.3。
3.4乳糖-明膠培養基:見附錄 A 中 A.4。
3.5含鐵牛乳培養基:見附錄 A 中 A.5。
3.60.1%蛋白胨水:見附錄 A 中 A.6。
3.7革蘭氏染色液:見附錄 A 中 A.7。
3.8硝酸鹽還原試劑:見附錄 A 中 A.8。
3.9緩沖甘油-氯化鈉溶液:見附錄A中 A.9。
4 檢驗程序
產氣莢膜梭菌檢驗程序見圖 1。



5?操作步驟
5.1?樣品制備
5.1.1?樣品采集后應盡快檢驗,若不能及時檢驗,可在 2 ℃~5 ℃保存;如 8 h 內不能進行檢驗,應以 無菌操作稱取 25 g(mL)樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液(液體樣品應加雙料),并盡快至于-60 ℃ 低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。
5.1.2?以無菌操作稱取 25 g(mL)樣品放入含有 225 mL 0.1%蛋白胨水(如為 5.1.1 中冷凍保存樣品, 室溫解凍后,加入 200 mL 0.1%蛋白胨水)的均質袋中,在拍擊式均質器上連續均質 1 min~2 min;或 置于盛有 225 mL0.1%蛋白胨水的均質杯中,8 000 r/min~10 000 r/min 均質 1min~2 min,作為 1:10 稀釋 液。
5.1.3?以上述 1:10 稀釋液按 1 mL 加 0.1%蛋白胨水 9 mL 制備 10-2~10-6的系列稀釋液。

5.2培養

5.2.1吸取各稀釋液 1 mL 加入無菌平皿內,每個稀釋度做兩個平行。每個平皿傾注冷卻至 50℃的 TSC 瓊脂(可放置于 50℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)15mL,緩慢旋轉平皿,使稀釋液和瓊脂充分混勻。 5.2.2上述瓊脂平板凝固后,再加 10mL 冷卻至 50℃的TSC瓊脂(可放置于 50℃±1 ℃恒溫水浴箱 中保溫)均勻覆蓋平板表層。
5.2.3待瓊脂凝固后,正置于厭氧培養裝置內,36℃1℃培養20 h~24 h
5.2.4典型的產氣莢膜梭菌在 TSC 瓊脂平板上為黑色菌落。
5.3確證試驗
5.3.1從單個平板上任選 5 個(小于 5 個全?。┖諫?,分別接種到 FTG 培養基,36℃±1℃培養
18 h~24h。
5.3.2用上述培養液涂片,革蘭氏染色鏡檢并觀察其純度。產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌,有 時可見芽孢體。如果培養液不純,應劃線接種 TSC 瓊脂平板進行分純,36 ℃1℃厭氧培養 20 h~24 h, 挑取單個典型黑色菌落接種到 FTG 培養基,36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h,用于后續的確證試驗。
5.3.3取生長旺盛的 FTG 培養液 1 mL 接種于含鐵牛乳培養基,在 46 ℃±0.5 ℃水浴中培養 2 h 后,每 小時觀察一次有無“暴烈發酵”現象,該現象的特點是乳凝結物破碎后快速形成海綿樣物質,通?;嶸? 升到培養基表面。5 h 內不發酵者為陰性。產氣莢膜梭菌發酵乳糖,凝固酪蛋白并大量產氣,呈“暴烈發 酵”現象,但培養基不變黑。
5.3.4用接種環(針)取 FTG 培養液穿刺接種緩沖動力-硝酸鹽培養基,于 36 ℃±1 ℃培養 24 h。在透 射光下檢查細菌沿穿刺線的生長情況,判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長,無動力的菌 株只沿穿刺線生長。然后滴加 0.5 mL 試劑甲和 0.2 mL 試劑乙以檢查亞硝酸鹽的存在。15 min 內出現紅 色者,表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽;如果不出現顏色變化,則加少許鋅粉,放置 10 min,出現紅色者, 表明該菌株不能還原硝酸鹽。產氣莢膜梭菌無動力,能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。
5.3.5用接種環(針)取 FTG 培養液穿刺接種乳糖-明膠培養基,于 36 ℃±1 ℃培養 24 h,觀察結果。 如發現產氣和培養基由紅變黃,表明乳糖被發酵并產酸。將試管于 5 ℃左右放置 1 h,檢查明膠液化情況。 如果培養基是固態,于 36 ℃±1 ℃再培養 24 h,重復檢查明膠是否液化。產氣莢膜梭菌能發酵乳糖,使 明膠液化。

6結果與報告

6.1典型菌落計數
選取典型菌落數在 20 CFU~200 CFU 之間的平板,計數典型菌落數。如果:
a)只有一個稀釋度平板的典型菌落數在 20CFU~200CFU 之間,計數該稀釋度平板上的典型菌落;
b)最低稀釋度平板的典型菌落數均小于 20 CFU,計數該稀釋度平板上的典型菌落;
c)某一稀釋度平板的典型菌落數均大于 200 CFU,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,應計數該稀 釋度平板上的典型菌落;
d)某一稀釋度平板的典型菌落數均大于 200 CFU,且下一稀釋度平板上有典型菌落,但其平板上的 典型菌落數不在 20 CFU~200 CFU 之間,應計數該稀釋度平板上的典型菌落;
e)2 個連續稀釋度平板的典型菌落數均在 20CFU~200CFU 之間,分別計數 2 個稀釋度平板上的典 型菌落。
6.2?結果計算
6.1 計數結果按公式(1)計算:

式中:
T——樣品中產氣莢膜梭菌的菌落數;
A——單個平板上典型菌落數;
B——單個平板上經確證試驗為產氣莢膜梭菌的菌落數;
C——單個平板上用于確證試驗的菌落數;
n1——第一稀釋度(低稀釋倍數)經確證試驗有產氣莢膜梭菌的平板個數;
n2——第二稀釋度(高稀釋倍數)經確證試驗有產氣莢膜梭菌的平板個數;
0.1——稀釋系數;
d——稀釋因子(第一稀釋度)。
6.3報告
根據 TSC 瓊脂平板上產氣莢膜梭菌的典型菌落數,按照 6.2 中公式計算,報告每 g(mL)樣品中產 氣莢膜梭菌數,報告單位以 CFU/ g(mL)表示;如 T 值為 0,則以小于 1 乘以最低稀釋倍數報告。

食品微生物學檢驗2012標準
食品微生物學檢驗2012標準(GB 4789)已于2012-05-17正式頒布并于2012-07-17開始實施.
詳細請看:
GB 4789-2012檢驗標準
GB 4789-2012培養基目錄
食品微生物學檢驗2012標準
GB 4789.5-2012 志賀氏菌檢驗
GB 4789.13-2012 產氣莢膜梭菌檢驗
GB 4789.34-2012雙歧桿菌的鑒定
GB 4789.38-2012大腸埃希氏菌計數
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