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食品安全國家標準-食品微生物學檢驗

126码报资料:食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗(GB 4789—2012)

錄入時間:2012-7-9 9:02:54 來源:國家衛生部

2019码报资料046期 www.bjbve.icu 前言
本標準代替GB/T 4789.5-2003《食品衛生微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗》。
本標準與 GB/T 4789.5-2003 相比,主要變化如下:
——修改了標準名稱;
——修改了培養基和試劑;
——修改了操作步驟中增菌部分和生化試驗及附加生化試驗部分;
——修改了表2
——修改了表4

食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗
1 范圍
本標準規定了食品中志賀氏菌(Shigella)的檢驗方法。
本標準適用于食品中志賀氏菌的檢驗。。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
a) 恒溫培養箱:36 ℃ 1 ℃;
b) 冰箱:2 ℃~5 ℃;
c) 膜過濾系統;
d) 厭氧培養裝置:41.5 ℃?1 ℃;
e) 電子天平:感量 0.1 g;
f) 顯微鏡:10 ~100 ;
g) 均質器;
h) 振蕩器;
i) 無菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭;
j) 無菌均質杯或無菌均質袋:容量 500 mL;
k) 無菌培養皿:直徑 90 mm;
l) pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙;
m) 全自動微生物生化鑒定系統。
3? 培養基和試劑
3.1 志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素:見附錄 A 中 A.1。
3.2? 麥康凱(MAC)瓊脂:見附錄 A中 A.2。
3.3? 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(XLD)瓊脂:見附錄 A 中 A.3。
3.4? 志賀氏菌顯色培養基。
3.5 三糖鐵(TSI)瓊脂:見附錄 A中 A.4。
3.6? 營養瓊脂斜面:見附錄 A? 中 A.5。
3.7 半固體瓊脂:見附錄 A 中 A.6。
3.8 葡萄糖銨培養基:見附錄 A中 A.7。
3.9? 尿素瓊脂:見附錄 A中 A.8。
3.10? β-半乳糖苷酶培養基:見附錄 A中 A.9。
3.11 氨基酸脫羧酶試驗培養基:見附錄 A中 A.10。
3.12 糖發酵管:見附錄 A 中 A.11。
3.13 西蒙氏檸檬酸鹽培養基:見附錄 A中 A.12。
3.14 粘液酸鹽培養基:見附錄 A 中 A. 13。
3.15 蛋白胨水、靛基質試劑:見附錄 A中 A.14。
3.16 志賀氏菌屬診斷血清。
3.17 生化鑒定試劑盒。
4 檢驗程序
志賀氏菌檢驗程序見圖 1。



5? 操作步驟
5.1 增菌
以無菌操作取檢樣 25 g(mL),加入裝有滅菌 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質杯,用旋轉刀片式均 質器以 8 000 r/min~10 000 r/min 均質;或加入裝有 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質袋中,用拍擊式均質 器連續均質 1 min~2 min,液體樣品振蕩混勻即可。于 41.5 ℃±1℃,厭氧培養 16 h~20 h。
5.2 分離
取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于 XLD 瓊脂平板和 MAC 瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養基平板 上,于 36 ℃±1 ℃培養 20 h~24 h,觀察各個平板上生長的菌落形態。宋內氏志賀氏菌的單個菌落直徑大 于其他志賀氏菌。若出現的菌落不典型或菌落較小不易觀察,則繼續培養至 48 h 再進行觀察。志賀氏菌在 不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見表 1。

5.3 初步生化試驗
5.3.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落,分別接種TSI、半固體和營養瓊脂斜面各一 管,置36 ℃±1 ℃培養20 h~24 h,分別觀察結果。
5.3.2 凡是三糖鐵瓊脂中斜面產堿、底層產酸(發酵葡萄糖,不發酵乳糖,蔗糖)、不產氣(福氏志賀氏 菌6型可產生少量氣體)、不產硫化氫、半固體管中無動力的菌株,挑取其5.3.1中已培養的營養瓊脂斜面 上生長的菌苔,進行生化試驗和血清學分型。
5.4 生化試驗及附加生化試驗
5.4.1 生化試驗
用 5.3.1 中已培養的營養瓊脂斜面上生長的菌苔,進行生化試驗,即 β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫 羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗。除宋內氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌 13 型的鳥氨酸 陽性;宋內氏菌和痢疾志賀氏菌 1 型,鮑氏志賀氏菌 13 型的 β-半乳糖苷酶為陽性以外,其余生化試驗志賀 氏菌屬的培養物均為陰性結果。另外由于福氏志賀氏菌 6 型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相 似,必要時還需加做靛基質、甘露醇、棉子糖、甘油試驗,也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗,應為氧 化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應不符合的菌株,即使能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集,仍不得 判定為志賀氏菌屬。志賀氏菌屬生化特性見表 2。

5.4.2 附加生化實驗
由于某些不活潑的大腸埃希氏菌(anaerogenic E.coli)、A-D(Alkalescens-D isparbiotypes 堿性-異型) 菌的部分生化特征與志賀氏菌相似,并能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集;因此前面生化實驗符合志賀 氏菌屬生化特性的培養物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36 ℃培養 24 h~48 h)。志 賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D 菌的生化特性區別見表 3。

5.4.3 如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統,可根據5.3.2的初步判斷結果,用5.3.1中已培 養的營養瓊脂斜面上生長的菌苔,使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統進行鑒定。
5.5 血清學鑒定
5.5.1抗原的準備
志賀氏菌屬沒有動力,所以沒有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體(O)抗原。菌體 O 抗原又可分為 型和群的特異性抗原。
一般采用 1.2%~1.5%瓊脂培養物作為玻片凝集試驗用的抗原。
注 1:一些志賀氏菌如果因為 K 抗原的存在而不出現凝集反應時,可挑取菌苔于 1 mL 生理鹽水做成濃菌液,100 ℃煮 沸 15 min~60 min 去除 K 抗原后再檢查。
注 2:D 群志賀氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株,與其他志賀氏菌群抗原不存在交叉反應。與腸桿菌科不 同,宋內氏志賀氏菌粗糙型菌株不一定會自凝。宋內氏志賀氏菌沒有 K 抗原。
5.5.2 凝集反應
在玻片上劃出 2 個約 1cm×2cm 的區域,挑取一環待測菌,各放 1/2 環于玻片上的每一區域上部,在其 中一個區域下部加 1 滴抗血清,在另一區域下部加入 1 滴生理鹽水,作為對照。再用無菌的接種環或針分 別將兩個區域內的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合 1 min,并對著黑色背景進行觀察,如果抗血清 中出現凝結成塊的顆粒,而且生理鹽水中沒有發生自凝現象,那么凝集反應為陽性。如果生理鹽水中出現 凝集,視作為自凝。這時,應挑取同一培養基上的其他菌落繼續進行試驗。
如果待測菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征,而其血清學試驗為陰性的話,則按 5.5.1 注 1 進行 試驗。
5.5.3 血清學分型(選做項目)
先用四種志賀氏菌多價血清檢查,如果呈現凝集,則再用相應各群多價血清分別試驗。先用 B 群福氏 志賀氏菌多價血清進行實驗,如呈現凝集,再用其群和型因子血清分別檢查。如果 B 群多價血清不凝集, 則用 D 群宋內氏志賀氏菌血清進行實驗,如呈現凝集,則用其Ⅰ相和Ⅱ相血清檢查;如果 B、D 群多價血 清都不凝集,則用 A 群痢疾志賀氏菌多價血清及 1~12 各型因子血清檢查,如果上述三種多價血清都不凝 集,可用 C 群鮑氏志賀氏菌多價檢查,并進一步用 1~18 各型因子血清檢查。福氏志賀氏菌各型和亞型的 型抗原和群抗原鑒別見表 4。

5.6 結果報告
綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果,報告 25 g(mL)樣品中檢出或未檢出志賀氏菌。


 

食品微生物學檢驗2012標準
食品微生物學檢驗2012標準(GB 4789)已于2012-05-17正式頒布并于2012-07-17開始實施.
詳細請看:
GB 4789-2012檢驗標準
GB 4789-2012培養基目錄
食品微生物學檢驗2012標準
GB 4789.5-2012 志賀氏菌檢驗
GB 4789.13-2012 產氣莢膜梭菌檢驗
GB 4789.34-2012雙歧桿菌的鑒定
GB 4789.38-2012大腸埃希氏菌計數
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